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Testes de Viroses da Batata no Centro
de P&D Fitossanidade - APTA
Instituto Agronômico de Campinas (IAC)
José Alberto Caram de Souza Dias (Eng. Agr.
PhD) - Pesquisador Científico - Virologista APTA-
Instituto Agronômico de Campinas (IAC) - Centro
de Pesquisa e Desenvolvimento de Fitossanidade (CPDFitossanidade)
Laboratório de Viroses da Batata e Solanáceas
em Geral (LVBSG) - Av. Barão de Itapura 1481
(C. Postal 28) CEP: 13001-970 Campinas/ SP (Brasil)
(19) 3241.5188 - cel. (19) 9256.1961
jcaram@iac.sp.gov.br
Planta teste de Datura stramonium, inoculada com
PLRV por enxertia.
Sitoma de amarelo interneval.
As pesquisas e serviços de diagnose de viroses
da batata (Solanum tuberosum L.) têm uma longa
tradição no IAC. Tiveram início
na década de 1930, com o Dr. Álvaro Santos
Costa, de saudosa memória. As técnicas
de diagnose, ou tipo de testes, aplicados para a identificação
de viroses em tecidos de folhas ou tubérculos
de batata vêm acompanhando o estado-de-arte da
ciência, mas continuam a conviver e serem aplicados
de forma simultânea ou individual, dependendo
do tipo de virose ou da investigação que
se faz necessária. Os principais testes, mais
comuns na diagnose de rotina de viroses da batata, em
tecidos de folhas, tubérculos dormentes, brotos
etc, são:
Testes Biológicos: Identificação
de vírus baseada em sintomas de plantastestes,
indicadoras, via transmissão mecânica,
enxertia ou insetos vetores. Demanda espaço físico,
mão-de-obra na produção de plantas
e tempo (meses) para os resultados. Não são
específicos e limitados com relação
à sensibilidade. Geralmente aplicada quando não
se conhece ou se suspeita de qual vírus (se é
que seja vírus) estaria causando o sintoma em
questão.
Microplacas do ELISA, teste PVY em tubérculo
dormente (olho) à esquerda, amostra de campo
consumo - à direita, com ausência do vírus
- minitubérculos telado
Testes Imunológicos: Identificação
específica de vírus, através da
interação (captura) do antígeno
(tipo de vírus) pelo anticorpo específico
(imunoglobulina, IgG, obtido do soro do sangue de animal,
geralmente coelhos, após injetado/ inoculado
com solução purificada do vírus).
Essa captura é específica, isto é,
anticorpo contra o vírus do PLRV não interage
com vírus PVY e vice-versa. O tipo de teste imunológico
mais comum é o ELISA, em que uma enzima é
acoplada a um anticorpo secundário. Os kits contendo
anticorpos dos principais vírus da batata: PLRV,
PVY, PVS, PVX, além de Tospovirus (vira-cabeça),
Tobacco rattle vírus, Potato mop top vírus,
Alfafa mosaico vírus, e vários outros,
são adquiridos das principais empresas produtoras
como EMBRAPA-CNPH; Bio- Rad (França), ADGEN (Escócia),
AGDIA (EUA), IRI_Wageningen (Holanda), entre outros.
A vantagem principal do ELISA é sua alta especificidade,
sensibilidade e custo relativamente baixo, podendo ser
executado em grande número de amostras (geralmente
em nosso laboratório no IAC, testamos condições
de testar até 200 tubérculos
ou folhas por dia), com resultados em até 2 dias.
Ao longo dos últimos 15 anos, já foram
realizados cerca de 600 mil testes para atender produtores
e trabalhos de pesquisa. Como desvantagens, observam-se
casos de falso positivo (presença) ou falso negativo
(ausência) para o vírus em teste. Julgar
e evitar esses casos demanda experiência do laboratorista
e modo de operação das amostras, bem como
qualidade dos reagentes empregados.
Testes moleculares: Baseado na identificação
de áreas específicas do genoma , ou seja,
do código genético do vírus. O
teste mais conhecido atualmente é o PCR, em que
uma enzima denominada polimerase, após 30 a 40
ciclos de altas e baixas temperaturas, amplifica em
muitos milhões de vezes uma determinada área
do genoma do vírus para a qual foi produzida
uma sonda (primer), codificada para reconhecer o genoma
do vírus e dar início e fim à região
amplificada. Dessa forma, o produto amplificado do genoma
pode ser visto, isolado e seqüenciado para comparação
com genomas semelhantes em banco de germoplasma. Tratam-se
de técnica muito maior sensitividade e especificidade
do que o ELISA.
Entretanto, é mais cara e demanda equipamentos
e estruturas laboratoriais mais complexas para suas
análises. Tem sido, por isso, limitada para uso
em casos de necessidade de confirmação
de determinados vírus ou raças, como,
por exemplo, a raça NTN do PVY (PVYNTN), ou outras
raças do PVY, como a recentemente identificada
na cv. Monalisa (região de Casa Branca- SP),
denominada “encrespamento”.
PCR para PLRV. Primers UP3 e DP4. Colunas 1a 4 indica
o PLRV (358 pares de base -pb amplificado de tubérculos);
5-7 sadios; 8 padrão 123 pbs,
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